二倍体细胞和“丑闻”缠身的海弗里克
1950年,年轻的研究员莱昂纳多·海弗里克加入了费城久负盛名的威斯塔研究所(The Wistar Institute),在其建议下,他开始研究肿瘤病毒。技术层面上,就是将肿瘤组织碎末注射进细胞后,查证是否还有病毒存在。海弗里克培养的人类胚胎细胞是从治疗性流产中获得的。
他之所以选择这样的细胞注入肿瘤组织匀浆,是因为它们与从成人身上提取的细胞不同,几乎不存在携带感染性病毒的可能性,不会影响结果。
这一计划并没有获得实质性成功,因为由始至终并未提取出任何病毒。但是海弗里克和他的合作者——保罗·穆尔黑德(Paul Moorhead)博士却观察到一类特殊胚胎细胞的明显增多,即成纤维细胞。后者在培养皿中显著增多,几天后当一个细胞层形成时,用胰蛋白酶就有可能将它们提取出来。那些分散的细胞由此就可能得到再次培养,这种连续性移植在业内被称为“传代”。就是这样,海弗里克和穆尔黑德可以连续几周,甚至几个月定时得到有活力的培养细胞。但是,细胞一段时间后就会无可避免地死亡。
在当时,由卡雷尔创立的“细胞永生论”仍然被世人所信服,于是细胞的迅速死亡被归咎于操作者的无能,或不适宜、甚至有毒的培养环境。而海弗里克和穆尔黑德并不认为自己没有培养细胞的能力。实际上,那些死去的“年老”细胞恰恰和正在培育的“年轻”细胞处于同一个环境之中,他们从这一点推断出:细胞并不能“长生不老”,它们的存活时长是有定数的[32] 。
到了1961年,海弗里克和穆尔黑德决定将他们的成果公布于世。二人投稿给《实验医学杂志》(Journal of Experimental Medicine,JEM ),却不想被泼了冷水。拒稿理由:文章内容与当时公论不一致。
审稿人这样写道:“近半个世纪以来,细胞培养的频频失败是由不恰当的培养环境造成的。”至于两位作者提出的细胞死亡是源于衰老现象,一位审稿人回复道:“关于细胞死亡是由内在衰老现象造成的这一假设看起来极其大胆且缺乏文献依据。”写下这一评语的,正是该领域的权威之一裴顿·劳斯,我们在前文也提到过。他后来因发现了病毒在某些癌症中所扮演的角色而获得诺贝尔生理学或医学奖。简言之,这一记耳光十分响亮,可是按当时的认识水平却也完全在理。
海弗里克于是决定将本文另投他处:《实验细胞研究杂志》(Experimental Cell Research ),令他喜出望外的是,稿件被接收了,也没有提出重大的修改要求。此文就是《人二倍体细胞株的连续培养》[33] ,迄今为止还是科学界被引用次数最多的文献之一。这篇文章讲了什么呢?海弗里克是这么说的,如果我们将成纤维细胞从人类胚胎中分离出来,不管是用物理手段——镊子,还是化学方法——胰蛋白酶,然后将它们置于环境适宜的培养器皿中,这些细胞就会繁殖下去。
当细胞的数量达到饱和时,我们就能将它们一分为二,分装到两只培养瓶中,之后细胞就会继续繁殖。据海弗里克的阐释,多次重复这一流程是有可能的。我们就此可以观察到,每次分装细胞的数量都会翻番,这可是不得了的。因为n次分装之后,细胞的数量会变成原始数量的2n倍。例如,10次传代之后,细胞的数量增至原来的210倍,就是要乘以1024了。
在5次传代之后,海弗里克注意到细胞状态恶化并相继死亡,其间伴随着细胞碎屑的增多,这一最后阶段被称为“衰老期”。在不同的传代培养中,细胞核的检测,即细胞染色体测定未显示任何非正常现象。
这就是说,培养出的细胞与原始细胞一致,并仍然满足2N=46公式[34]。事实上,在一个具有有性生殖能力的有机体生命周期之中,变化会接连发生。在二倍体阶段,细胞的染色体都存在双份,人类染色体公式此时可写作2N=46;而在单倍体阶段,此公式为N=23(针对人类来说)。
染色体组型在二倍体阶段形成,所以其公式写作2N=46。海弗里克将这些细胞称为“二倍体细胞”(见第28—29页)。
这是一个重大发现。实际上,在这一阶段,人们只了解原代细胞(如猴肾细胞)和转化细胞。后者也被称之为“异倍体细胞”或“线性细胞”(见第28—29页),它们可以无限制地繁殖(我们会在下一段中予以详细介绍)。所以可以说海弗里克将一组新的细胞加入了这一队列,即源自胚胎的人二倍体细胞。
海弗里克迅速察觉到这一发现具有广泛的应用前景,尤其是疫苗生产的安全性有了保障。事实上正如我们在上文中指出的,原代细胞——尤其是猴肾细胞,有可能含有危险的病毒,疫苗有被感染之风险。
这时,虽然海弗里克还需要做大量的工作,证明二倍体细胞可用于制备疫苗,但他的建树已在世界范围内得到认可。然而,历史却发生了一个急转弯:1977年,《研究》(La Recherche )杂志刊发了一篇文章,在题目中冠之以“臭名昭著的海弗里克博士”——他不再是大众眼中优秀的研究者了。
让我们回望海弗里克遭受的这一磨难。在工作中,他准备了不同谱系的二倍体细胞,以WI(威斯塔研究所的代称)为它们命名,并按照时间顺序称之为WI-1、WI-2等。1962年6月,他制造出了一个新的谱系,WI-38,这是由瑞典一家医院的流产手术中提取出来的女婴“胚肺细胞”[35] 而来。在第8次传代时,海弗里克已经培养出了600个安瓿瓶的细胞,并用极低的温度保存在液氮中。WI-38后来成为全世界二倍体细胞的代表,却也给海弗里克带来了麻烦事。美国国立卫生研究院(National Institutes for Health,NIH)与海弗里克博士就该细胞的使用签订了合同,收到请求后,这些细胞就会被发往全世界。很快,海弗里克就恍然大悟,有私立机构正从中牟取暴利。尽管他本人慷慨地无偿捐献了这些细胞,一些企业却囤积居奇,获赠后转手卖给以问诊和科研为目的的医院和研究中心渔利。
据海弗里克估算,几年内制药商们因WI-38细胞而获得的利润高达2000万美元,赚得盆满钵满,而他本人、威斯塔研究所及美国国立卫生研究院都未能从中分得一杯羹。1962年,威斯塔研究所曾尝试为WI-38细胞申请专利,可那时以自然活性形式存在的物质是无法申请专利的——该细胞没有经过任何修改,它是天然的。要等到1978年,美国最高法院才通过第一例天然活性组织的专利申请,对象是一种细菌。
1962年时,库存的WI-38细胞是美国国立卫生研究院的财产,即属于美国政府。1962—1968年期间,瓶装的WI-38细胞会被定期发送给不同实验室。1968年,海弗里克从威斯塔研究所辞职,加入位于加利福尼亚的斯坦福大学。他与美国国立卫生研究院签订的合同规定,只有10瓶细胞属于海弗里克本人,用于他的研究;而剩余的400瓶左右则归国立卫生研究院所有。但是当海弗里克离开威斯塔研究所时,他带走了所有的细胞瓶,他认为那是自己的“孩子”。
细胞瓶到底归谁所有?他与美国国立卫生研究院的恩恩怨怨就此开始。当国立卫生研究院重新找回剩下的细胞瓶时,就只有50只了。其他的去哪儿了呢?海弗里克申明一直在无偿提供分发那些细胞,许多都送给了英国的实验室,但有一些不幸在运输途中被打碎了。但是国立卫生研究院得知,海弗里克成立了一家公司,名为“联合细胞”(Cell Associates)。这家公司只有两名股东,海弗里克以及——他的配偶。
这家家族企业出售了一些细胞瓶,主要交易对象是制药巨头默克,交易额总计100万美元[36] 。而默克作为重要的疫苗生产商,正企图略施巧计将WI-38细胞据为己有,实现基本垄断,因为那时这种细胞已经被广泛用于疫苗的生产了。
这时,一个谣言甚嚣尘上,令这件事再起波澜。传言说,海弗里克剩下的细胞瓶已经感染了一种微生物,不能再使用了,他本人好像也早就知道有一些细胞瓶遭到了污染。这些被感染了的细胞也分发出去了吗?海弗里克予以否认。不过,一波未平,一波又起:国立卫生研究院怀疑他提供的细胞传代次数过多。海弗里克本来应该提供只传代了8次或9次的细胞,然而调查显示,发出的细胞里有的传代次数远高于这一标准。这可不是鸡毛蒜皮之事,要知道传代次数越多,细胞寿命越短。
事情发展到这一步,其中的真相愈加扑朔迷离。即便里面没有种种猫腻,至少海弗里克对于细胞瓶库存的管理是一塌糊涂的。时间推进到1976年,海弗里克从斯坦福大学辞职。不难想象,因为卷进这件事而麻烦缠身的海弗里克很难再找到新职位了。给海弗里克和他的WI-38细胞雪上加霜的是:只剩50瓶细胞了(可能还被污染了),这种细胞变得前途未卜;而剩下的细胞瓶被很快分发出去,这个细胞系用完了。
科学界对海弗里克的看法莫衷一是。当时供职于威斯塔研究所的斯坦利·普洛特金(Stanley Plotkin)教授曾用一句话描述了他这位同事所遭遇的悲剧:“这是一部真正的希腊式悲剧,英雄登上了他荣誉的顶峰,却也萌发了令他一落千丈的种子。”
海弗里克有错吗?抑或他本人也是荒谬体系的受害者?再回首,我们才恍然大悟,看清此事的来龙去脉:研究者与卫生部签订了合约,在此期间工作获得了重大发现(WI-38细胞)并将之无偿地提供给了需求方,最后该成果居然被一些不择手段的国际制药企业用于谋取巨额利润。制药商们赚得盆满钵满,研发者本人及资助了该研究的国家机构却一无所获、官司缠身。
从1976年起,海弗里克为洗雪冤屈而踏上了与美国行政机构对抗的漫漫长路,历时整整六个春秋。1981年,他终于赢得了诉讼。所有涉案细胞瓶的销售盈利都直接归属他本人,WI-38细胞的所有权由他和国立卫生研究院共有。他援引了1977年出台的一部关于活性微生物专利的法律,里面有这样一句话:“本法不反对将微生物纳入专利系统,令发现者或创造者受益。”现在,私立或公立机构已经申请了数千份与活性微生物有关的专利(不论相关微生物是否被改变过)。
海弗里克的胜利一锤定音。里根政府后来鼓励公立部门的研究者们申请专利,专利产生的一部分利润直接归属科研人员。该政策旨在促进行业竞争,提高美国的科研生产力。几年后,美国人成为生物技术领域毋庸置疑的领导者。海弗里克对这一转变做出了重要贡献,他面对美国行政部门的抗争掀开了该国生物医学史上新的一页。
让我们重新回到疫苗的生产上来。正如我们讲过的,20世纪70年代初,抗病毒疫苗多由原代细胞制备而来,主要是猴肾细胞。大家也知道这种细胞有一个重大劣势:它们可能会藏有致病病毒,后者可能继续存在于疫苗之中。此外,如果使用这种方法制作上百万支疫苗的话,每年都需要数千只猴子。相反,二倍体细胞WI-38却具有众多优势:它源自人类、可接受多种检测、不包含任何感染原、可使用低温细胞库贮存。
人们只要解冻一个细胞瓶,就可通过连续传代的方式令细胞繁殖,几周之内,就能获得数十亿个细胞用于制造疫苗。总而言之,二倍体细胞看起来好像十全十美。然而,美国主管部门——食品药品监督管理局(U.S.Food and Drug Administration,FDA)多年后才接受了这一点。
我们就没有任何可以怪罪二倍体细胞的地方吗?只能批评它太新潮了?可作反驳的论据几乎是不存在的,但反对者们[37] 提到了以下风险:这种细胞有可能携带一种现在人们未能察觉的病毒。原代细胞和二倍体细胞的对立在专家之中引起了热烈讨论。其中,美国食品药品监督管理局的生物制品办公室主任作了表态,说出了堪称美国医学史上谨慎精神的金句:“宁尝昨日痛,不犯未知险。”也就是说,还是要继续使用我们已经知根知底的原代细胞,尽管它也不是万全之策。
但是最终胜负还未决出。海弗里克和斯坦利·普洛特金(当时后者刚刚用二倍体细胞研发出了风疹疫苗,前景广阔)带领美国一众研究者们,又踏上了推广二倍体细胞的征途。他们的宗旨是:“给卫生当局上一课!”这一号召得到了欧洲一些国家卫生部门的响应,比如英国、法国、南斯拉夫,它们是20世纪70年代第一批批准将二倍体细胞用于疫苗制备的国家。美国则在数年后才开了绿灯,法国生产的人二倍体细胞狂犬疫苗开始在美国销售使用。而普洛特金的风疹疫苗直到1979年才在美国获批,比英国的放行还晚了9年。
今天,WI-38细胞已经退出了历史舞台:它已经被MRC5细胞[38] 取代。这是由伦敦的医学研究委员会(Medical Research Council)研发出的二倍体细胞,是对WI-38的仿制(海弗里克经常会提起这一点)。
许多现代使用的疫苗都是由MRC5制备而来,例如,狂犬疫苗、风疹疫苗、甲肝疫苗、脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗、流行性腮腺炎疫苗等。
其实,海弗里克博士又何谈臭名昭著?关于使用二倍体细胞制作疫苗的争论还远未停止。2003年,当时的红衣主教若瑟·拉青格(Joseph Ratzinger)——后来的教皇本笃十六世,加入了反对二倍体细胞WI-38和MRC5的阵营之中,由于这些细胞来自流产后的人类胚胎,他要求不再将这种细胞用于疫苗。普洛特金的风疹疫苗最受苛责,但是这种疫苗获得了巨大成功以至于完全取代了其他同类疫苗(其中就有一些是用其他细胞载体制成的)。这种疫苗已经不可或缺了,它被纳入了多个联合疫苗[39] ,如麻风腮三联疫苗[40] (MMR)。宗座科学院[41](Pontifical Academy of Sciences)在进行了深入研究后,考虑到疫苗接种的益处,终于永远地接受了二倍体细胞在疫苗中的使用,但同时,仍然鼓励制药界研发使用其他细胞载体的新型疫苗。
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