猴肾原代细胞和诺贝尔奖桂冠
卡雷尔和他在洛克菲勒研究所的团队做了一些技术性工作,这些工作与“永生细胞系”的作弊毫无干系,且对于细胞培养条件的研究是十分有用的。不过我们还是要承认,20世纪40年代的细胞培养技术还远远不能满足人们寄予的厚望。
这一时期,许多研究者都热衷于脊髓灰质炎疫苗的研发。其中有三位佼佼者找到了敲门砖,即希拉里·柯普洛夫斯基[27] (Hilary Koprowski)、乔纳斯·索尔克和阿尔伯特·萨宾,他们会在下一章中隆重出场。有了思路之后,还要迈出实质性的一步:生产数量可观的脊髓灰质炎病毒以制备疫苗。而当时有一种观点已然深入人心:脊髓灰质炎病毒只能在神经细胞中培养,所以繁殖这种病毒的最常用方法是对猴脑进行活体注射。虽然萨宾已经阐述过人工体外培养神经细胞来繁殖病毒的可能性,但这种工艺的难度很高,所以并不具有实践价值。
这时,著名学府哈佛大学的三名研究者参与了进来,令此事柳暗花明。这三人就是约翰·安德斯(John Enders)、托马斯·韦勒(Thomas Weller)和弗雷德里克·罗宾斯(Frederick Robbins)。安德斯是他们实验室的老板,更是一位老将,而另两位则是初出茅庐的新人,因为获得了美国国家研究委员会(National Research Council)的短期奖学金才得以进入该实验室。罗宾斯刚刚上岗时,就向安德斯表达了心声:他不想像当时大多数美国研究者一样从事脊髓灰质炎病毒的研究,真正令他感兴趣的是引起痢疾的病毒。韦勒则对水痘疫苗的研究情有独钟。
当时的细胞培养技术十分简陋:就是将人体组织的碎片悬置于充满营养液的试管中,并且每四天更换一次营养液,在其中加入可能含有病毒的样本。但相对于卡雷尔称雄的时代,这一技术仍然凸显了决定性进步:抗菌素,即青霉素和链霉素的使用有利于抑制细胞培养中的细菌生长,特别是可用于病人粪便的病毒性研究。
现在我们将时间的罗盘推进到1948年3月,此时罗宾斯正在尝试运用鼠肠细胞繁殖痢疾病毒,韦勒则在培养人胚胎细胞。罗宾斯谈道:“我无法使这种病毒繁殖。我把这件事告诉了老板,同时向他提出我需要尝试另一种病毒。”安德斯回答他说:“我寻思是否应尝试研究脊髓灰质炎病毒。毕竟,人类感染这种病时,病毒是在肠道内繁殖的,可为什么老鼠的肠道不会感染这种病毒呢?”罗宾斯觉得这一看法有理。他们的实验室当时存有Ⅱ型脊髓灰质炎病毒株,即可致死老鼠的“Lansing病毒株”。罗宾斯从冷柜中取出该病毒株并将其注射进老鼠的肠道细胞中,同时建议韦勒对不同的人体胚胎细胞进行同样操作。令三人大感惊奇的是,Ⅱ型脊髓灰质炎病毒竟不是在罗宾斯试验的肠道细胞中开始繁殖,而是在韦勒准备的不同人体胚胎组织中。哈佛的“三驾马车”第一次成功地在非神经细胞中实现脊髓灰质炎病毒的繁殖,这将在病毒学家们的世界中掀起一场技术革命。
他们还有另一发现,与培养环境中的酸碱指示剂——苯酚红有关:
细胞繁殖时会产生一种酸,从而使培养环境的颜色从红色变成橙色,最后成为黄色;然而,当阻碍细胞繁殖并摧毁细胞的病毒存在时,培养的环境仍然保持红色。用显微镜观察到的结果也证实了这一点:当培养环境保持红色时,其中的细胞已经被病毒破坏了。颜色的改变令培养环境可视化,人们就能轻易判断出脊髓灰质炎病毒是否存在其中。更为可喜的是,这种方法可以帮助人们为样本中的病毒定量(我们使用“滴定”这个术语),而之前工作人员要借助数十只动物才能完成病毒量测定。1949年1月28日,安德斯、罗宾斯和韦勒的工作成果在《科学》杂志发表,文章题为《不同人类胚胎组织中脊髓灰质炎“Lansing病毒株”的培养》[28] 。同样的方法显示脊髓灰质炎的另外两种病毒株(Ⅰ型和Ⅲ型)也以类似的方式繁殖。
故事的后续对脊髓灰质炎疫苗的发展产生了重大影响。脊髓灰质炎病毒被证实可在猴肾细胞中迅速繁殖(这些细胞被称为“原代细胞”,见下文楷体字)。病毒量化繁殖的大门已经开启,脊髓灰质炎疫苗的批量生产有了一丝曙光,并于几年后成为现实。
原代细胞、二倍体细胞和异倍体细胞细胞培养的漫长历史可被划分为三个阶段:原代细胞、二倍体细胞和异倍体细胞的培养。
原代细胞培养,即对一个器官或其一部分的培养。通过一种酶——胰蛋白酶将细胞提取出来,进行培养。提取出的细胞会用玻璃器皿盛装,如培养瓶、试管或载玻片,再注入培养成分。细胞开始繁殖并形成细胞层,它们的生命周期很短。
20世纪60年代,海弗里克博士观察到从人类胚胎中提取的成纤维细胞可通过连续移植进行繁殖。当细胞层形成时,可使用胰蛋白酶将细胞分离出来并移入两个新的培养瓶。同样的操作可重复50余次。此外,细胞也会衰老、死去。由此得到的细胞在存活时完全正常,染色体也未出现任何异常。这种细胞被称为“二倍体细胞”。
后来,我们开始从肿瘤中提取细胞进行培养。这种细胞可无限繁殖,被称为“线性细胞”。它们被“改变过”,染色体的结构或数量存在异常现象,或二者皆有。人们把这种细胞称为“异倍体细胞”。这种变异的细胞也可从非恶性肿瘤的细胞获得。
索尔克和萨宾在这一领域进行了深耕。前者研发出了灭活的脊髓灰质炎疫苗,后者则研制出了减毒的口服脊髓灰质炎疫苗。这两种疫苗是病毒学和现代疫苗学的里程碑,也是第一批采用细胞培养研制出的疫苗。疫苗家族从这种技术中受益良多,却也不乏艰险。一个个故事和事故由此展开,并永远成为疫苗学历史不可抹去的一页(见下一章)。
1954年,安德斯、韦勒和罗宾斯因他们在细胞培养领域的工作,获得了当年度的诺贝尔生理学或医学奖。
猴肾细胞迅速成为细胞培养领域的宠儿,在疫苗的生产中广为应用,但是一些间或发生的悲剧性事件又给这种使用的合理性蒙上了不确定性的面纱。1960年,人们发现了SV40病毒[29] ,即猴空泡病毒。这种存活在猴肾细胞中的病毒能够感染脊髓灰质炎疫苗。万幸,这事未对当时的公共卫生安全造成影响(见第二章)。
然而这并不是唯一的危险信号,几年之后,欧洲制药界上演了一场悲剧。1967年的八九月间,贝尔格莱德(Belgrade)和法兰克福(Francfort)的制药实验室工作人员纷纷染上了一种神秘的疾病。最后共有37人患病,其中7人不幸罹难。这些被感染者全部与为制备疫苗而从乌干达运来的长尾猴(也称绿猴[30] )接触过,他们中既有制药人员,也有饲养员。所有病例都表现为发热,尔后出现出血症状。人们那时尚不了解此事件中出现的病毒,暂命名为“马尔堡(Marburg)病毒”[31] 。这种病毒与一样可怕的埃博拉病毒是“堂兄弟”,同属纤丝病毒科(Filoviridae)。调查显示,在猴子的运输过程中,乌干达的出口方和欧洲的制药实验室都没有遵守动物检验检疫的相关规定。
这一突发状况令原代细胞的可靠性大打折扣,尤其是猴肾细胞最受质疑。可是,在20世纪60年代,人们还未找到其他能够接受的细胞载体用于制备疫苗,真正的决定性进步直到十几年后才姗姗来迟。一位个性颇受质疑的医生锲而不舍,方才迈出了这一步,他就是莱昂纳多·海弗里克。
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